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El virus del SIDA (VIH) como herramienta de terapia génica

23 octubre, 2011

El VIH infecta una clase de linfocitos, lo que acarrea un tipo de inmunodepresión conocido como SIDA. El virus introduce su material genético en el genoma de la célula huésped, desde donde controla la producción de nuevas partículas víricas. La secuencia del genoma del VIH es conocida, lo que ha permitido modificar dicho virus para generar vectores capaces de introducir genes de interés en el cromosoma de la célula huésped, en un proceso conocido como terapia génica. Este artículo resume brevemente cómo se han confeccionado dichas herramientas a partir de un VIH infectivo.

Se conoce como terapia génica la inserción de copias funcionales de un gen en una célula, tejido u organismo que carece de dicha copia, o posee una copia defectiva del mismo. Existen múltiples enfermedades hereditarias que se ocasionan como consecuencia de una mutación que provoca la pérdida la pérdida de la función de un gen. Algunas de esas enfermedades son incapacitantes y pueden provocar la muerte prematura de su portador.

Una teórica solución terapéutica consiste en la introducción de una copia funcional del gen en la célula, pero eso hasta el momento cuenta con dificultades técnicas y elevadad posibilidades de efectos colaterales no deseados, debido a alteraciones no previstas en el genoma del organismo receptor.

El principal problema técnico estriba en conseguir integrar el material genético en el genoma de la célula huésped. Se han desarrollado para ello toda una serie de vectores derivados de diversos virus. Estos vectores derivan de adenovirus, retrovirus, poxviryus, baculovirus y herpesvirus, que han sido modificados de tal forma que puedan incluir el gen de interés a la vez que han perdido su capacidad patogénica (Segura y col., 2011). En la actualidad alrededor del 45% de los ensayos de terapia génica se realizan con retrovirus o adenovirus (Warnock y col., 2010).

Los vectores generados a partir de retrovirus reúnen una serie de características que los hacen muy atractivos para este tipo de trabajos: integran el material genético que llevan en los cromosomas de las células diana, un requisito imprescindible para una expresión duradera y estable; no codifican proteínas víricas, lo que evita una respuesta del sistema inmune hacia ellas y permiten clonar fragmentos de DNA de hasta 10 kilobases de longitud (Zufferey y col., 1997).

Los retrovirus más empleados hasta hace poco eran los oncoretrovirus, como el virus MLV que provoca leucemia en ratones. El problema es que esos vectores sólo pueden ser transducidos a células que se están dividiendo, porque el complejo de integración del MLV no es capaz de emigrar hacia el núcleo (no puede atravesar su membrana) con lo que ha de aprovechar cuando las células están en la fase de mitosis, en la que la membrana nuclear ha desaparecido (Roe y col. 1993). Esto limita mucho el uso de estos vectores ya que no pueden usarse en células que se dividan muy poco o no lo hagan, como las neuronas, los hepatocitos, los miocitos o las células madre hematopoyéticas.

Los lentivirus, como el VIH-1, que produce el síndrome de inmunodeficiencia humana, son capaces de infectan células que no se dividen ya que el complejo de integración es transportado al interior del núcleo de la célula huésped (Lewis y col., 1992; Bukrinsky y col., 1993; von Schwedler y col., 1994; Gallay y col., 1996). Los vectores basados en el VIH-1 también podrán translucir células que no se están dividiendo (Naldini y col., 1996). Además, los vectores basados en el VIH-1 pueden transportar, integrar y expresar genes exógenos en células que no se están dividiendo como por ejemplo las neuronas (Naldini, L., y col., 1996b).

Sin embargo, a pesar de las ventajas que parecen presentar los retrovirus, también hay que tener en cuenta ciertas precauciones. La primera es que el uso clínico de vectores derivados del VIH-1 puede tener como consecuencia el desarrollo de la patogénesis ligada al virus, si éste llega a reconstituirse. Para solventar ese problema se han diseñado vectores que lleven los diferentes componentes en fragmentos de ADN separados, lo que obligaría a una serie de recombinaciones consecutivas para regenerar una partícula infectiva. Pero, aunque la posibilidad es extremadamente baja, no puede descartarse del todo. Si todos y cada uno de los elementos patogénicos que lleva el virus son eliminados, entonces el nivel de bioseguridad es mucho mayor. Eso es precisamente lo que a hecho en los vectores de última generación que incrementan en varios órdenes de magnitud la seguridad.

Para asegurar al máximo esa seguridad se pueden delecionar los genes env, vif, vpr, vpu, nef y tat del VIH-1, lo que elimina su patogenicidad, pero no la capacidad de introducir DNA en la célula huésped. De hecho esas secuencias pueden ser sustituidas por otras exógenas.

Brevemente, y sin querer entrar en detalles moleculares complejos (si estáis interesados en las referencias encontraréis información más detallada) os comento que algunos de los vectores derivados del VIH-1 empleados hasta la fecha constan de una unidad central donde se inserta el gen que se quiere transducir y donde se han eliminado genes esenciales para la patogénesis. Los genes necesarios para la formación de las partículas viricas se aportan desde un plásmido y los genes que codifican para las proteínas que reconocen las envueltas celulares (Env), en otro. Para aumentar la capacidad de infección a otros tipos de células, los genes env del VIH-1, son sustituidos por receptores de glicoproteínas de membranas de la mayoría de las células, cambiando la especificidad por los linfocitos T hacia un rango casi universal de tejidos. Para ello se emplean en primer lugar sistemas in vitro que son transducidos con los vectores, de tal forma que se promueve el empaquetamiento de una partícula vírica capaz de infectar célula, integran el material genético (incluido el gen de interés), pero no de producir patogénesis ni producir nuevas partículas infectivas. Un resumen de todos los pasos necesarios los podéis ver AQUÍ

: Ejemplo de vector de empaquetamiento en el que se han delecionado diversas regiones del VIH-1

Un ejemplo lo constituye el trabajo presentado por Lois y colaboradores (2002), en el cual se utilizó un vector derivado del VIH-1 para introducir en células de ratón la proteína GFP, que es fluorescente cuando se irradia con luz ultravioleta. El vector construido (Figura 1) era portador del gen que codifica la GFP bajo el control del promotor ubiquitina-C. También se incluyó el elemento flap del VIH-1, que asegura unas concentraciones de vector viral elevadas.

Diagrama del vector generado a partir del VIH-1. Tomado de Lois y col., 2002

Se produjeron in vitro las partículas en células portadoras de los dos vectores que aportaban el resto de funciones necesarias para el empaquetamiento. Se sustituyó la región Env del VIH por una que codifica un receptor de glicoproteínas de membrana. Finalmente se obtuvieron partículas a una concentración de 10 elevado a 6 unidades infectivas por mililitro.

Del orden de 10 a 100 picolitros de virus concentrado se inyectaron en el espacio perivitelino de óvulos fecundados. Tras 72 horas tras la infección ya se pudo observar expresión de la GFP en la blástula o en la mórula de las células inyectadas. Los embriones fueron implantados en hembras de ratón pseudopreñadas (hormonalmente preparadas) y se esperó al parto. Se observó la expresión de la GFP en diversos tejidos de los ratones de los animales transgénicos, mientras que en los animales control no se observó fluorescencia (Figura 2).

Figura 2. Expresión de la GFP en la cara (A), pata (B), cerebro (C), corazón (D), hígado (E) y riñón (F) de animales transgénicos (marcados como TG). Se muestra fotografía de las partes de los animales irradiados con luz natural (BF) o ultravioleta (WT y TG). Se comparó la fluorescencia de animales transgénicos (TG) y silvestres (WT)

Experimentos de Southern-blot mostraron que una copia del gen gfp se había insertado en el genoma de los ratones transgénicos. Este desarrollo experimental tal complejo no ha sido diseñado para tener ratones fluorescentes a la luz ultravioleta como mascotas, se prueba una técnica experimental para el desarrollo de un protocolo de introducción de genes de interés. En otro artículo hablaré sobre los controles de bioseguridad, los problemas bioéticos y los resultados clínicos obtenidos del desarrollo de esta técnica.
De momento no está mal para un virus que algunos dicen que no existe, ¿no?

Para saber más sobre la replicación del VIH

Lecturas recomendadas

Bemelmans, A.P., y col. (2005) Retinal cell type expression specificity of HIV-1-derived gene transfer vectors upon subretinal injection in the adult rat: influence of pseudotyping and promoter. J. Gene Med. 7:1367-1374.

Bukrinsky, M.I., y col. (1993) A nuclear localization signal within HIV-1 matrix protein that governs infection of non-dividing cell. Nature 365:666-669.

Gallay, P., y col. (1996) Role of the karyophenin pathway in HIV-1 nuclear import. J. Virol. 70:1027-1032.

Giri-Laterrière, M., y col. (2011) Lentiviral vectors. En “Viral vectors for gene theraphy: methods and protocols”. Methods in Molecular Biology 737:183-209.

Hachiya, A., y col. (2007) Gene transfer in human skin with different pseudotyped HIV-based vectors. Gene Therapy 14:648-656.

Lewis, P., y col. (1992) Human immunodeficiency virus infection of cell arrested in the cell cycle. EMBO J. 11:053-3058.

Lois, C., y col. (2002) Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science 295:868-872.

McDonald, D., y col. (2002) Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells. J. Cell Biol. 159:441-452.

Naldini, L., y col. (1996) In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science 272:263-267.

Naldino, L., y col. (1996b) Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of transgene in adult rat brains injected with lentiviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388.

Roe, T., y col. (1993) Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis. EMBO J. 12:2099-2108.

Segura, M., y col. (2006) Downstream processing of oncoretroviral and lentiviral gene therapy vectors. Biotech. Adv. 24:321-337.

von Schwedler, U., y col. (1994) The nuclear localization signal of the matrix protein of human immunodeficiency virus type 1 allows the establishment of infection in macrophages and quiescent T lymphocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6992-6996.

Warnock, J., y col. (2010) Introduction to viral vectors. En “Viral vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols”. Methods in Molecular Biology, 737:1-25.

Zufferey, R, y col. (1997) Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotech. 15:871-875.

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Serie “VIH/SIDA


  1. Rhay
    23 octubre, 2011 en 14:29

    Voy a hacer una pregunta algo absurda y propia de un lego en la materia como es un servidor.

    Los inhibidores de proteasa, transcriptasa y demás, ¿sólo actúan sobre el material genético del VIH o impiden también el normal funcionamiento de la célula T4?

  2. 23 octubre, 2011 en 16:21

    Rhay, preguntas Los inhibidores de proteasa, transcriptasa y demás, ¿sólo actúan sobre el material genético del VIH o impiden también el normal funcionamiento de la célula T4?

    Desde que se empezaron a buscar moléculas que inhibiesen en algún punto el ciclo replicativo del VIH hasta hoy se ha mejorado mucho, aunque todavía se puede mejorar más. Las primeras moléculas que se pusieron a la venta fueron análogos de nucleósidos que actúan sobre cualquier sistema genético que se esté reproduciendo a alta velocidad (por eso también son antitumorales). En circunstancias normales estos compuestos no hubiesen pasado los controles de la FDA, pero la tasa de mortalidad existente para el SIDA en aquella época, junto con presiones de ciertos colectivos consiguieron que se aprobaran de una forma rápida. Esos primeros compuestos (por ejemplo el AZT) tienen muchos efectos secundarios, pero no específicamente sobre los linfocitos, sino sobre muchas células de rápida división de nuestro organismo.

    Mientras todo eso ocurría se siguió investigando; se secuenció el genoma del VIH y se empezó a conocer todas las moléculas que lo componían, así como muchos detalles de su “ciclo vital”. Eso ha permitido diseñar nuevos compuestos que bloquean de forma selectiva el reconocimiento de la célula huésped (anticuerpos monoclonales contra los receptores CCR5), el paso de RNA a DNA (retrotranscriptasa), la integración del ADN formado en nuestro genoma (integrasa) o la maduración del virus (proteasa). Pero somos seres vivos que hemos evolucionado a partir de un ancestro común, lo que significa que todos guardamos ciertas homologías en muchas de nuestras moléculas. Por ejemplo un inhibidor de una proteasa del virus también podría (al menos en teoría) bloquear alguna proteasa celular, por ejemplos si los centros activos son similares. A eso se une que algunas de esas sustancias pueden tener toxicidad sobre otros sistemas que a priori no tienen nada que ver. Por ejemplo la ampicilina inhibe la síntesis de la pared bacteriana y en principio no interfiere con nuestro metabolismo, pero se ha visto que tiene cierta toxicidad sobre células renales.

    Por todo ello se hacen experimentos de farmacocinética y farmacodinámica, para estimar la menor dosis que inhibe al virus a la vez que tiene el menor efecto tóxico sobre nuestro organismo. Eso da unos valores generales, que funcionarán en la mayoría de la población. Pero siempre aparecerán efectos de alergias y de toxicidad específicos en algunos pacientes (como también ocurre con otros muchos medicamentos) que obligarán a replantear y reformular el tratamiento.

    Resumiendo, la terapia que se usa hoy día contra el VIH no tiene un efecto tóxico específico sobre los linfocitos (algo que si tiene el VIH), sino que tiene efectos secundarios sobre algunos aspectos del metabolismo de muchas células del cuerpo.Esos efectos dependen mucho del paciente, ahí quienes realizan vida normal durante muchos años sin mostrar apenas efectos secundarios, otros requieren replantear la medicación por aparición de algún efecto adverso (por ejemplo toxicidad sobre células hepáticas). Espero haberte contestado la pregunta.

  3. Rhay
    23 octubre, 2011 en 16:49

    Lo has hecho. Muchísimas gracias, Manuel.

    La verdad es que la ciencia es mucho más fascinante que la conspiranoia, y estos son los casos que demuestran esta verdad.

  4. super8
    24 octubre, 2011 en 21:17

    MANUEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEL,te pregunto,tu trabajas con laboratorio propio o algo asi,ya que posees conocimientos bastos en la materia,o solo replicas lo que sale publicado en revistas cientificas,por que si tienes tu propio laboratorio y no tienes ninguna atadura con laboratorios que solo fabrican cosas que les benefician economicamente,si eres el dueño pues te sigo y felicito por el trabajo y aporte cientifico desinteresado y sin compromisos.

  5. 18 diciembre, 2012 en 20:52

    Maravillosamente explicado como siempre Manuel y lo comparto si me permites!!!! un abrazo y como siempre lo he dicho eres un gran divulgador!!!

  6. 18 diciembre, 2012 en 20:58

    Reblogged this on Desde Mendel hasta las moléculas and commented:
    Manuel explica el proceso con maravillosa sencillez. Espero que les sea de utilidad a todos y en especial a mis alumnos!!!! Gracias como siempre a La Ciencia y sus demonios por enriquecernos divulgando en castellano

  7. 18 diciembre, 2012 en 21:30

    Muchas gracias Gabriela, ya sabes que no necesitas permiso para compartirlo.
    Saludos

  8. Anónimo
    30 diciembre, 2013 en 17:01

    Si tienes tantos conocimientos por que no averiguas y subes información de los retrovirales sus causas y efectos motivo que mucha gente positiva no tiene idea solo les dan una pincelada en las cosultas y predicen los efectos primarios. Es bueno que coloques los inividores sus efectos a largo plazo….asumo que cuentas con esa información cierto?..

  1. 24 octubre, 2011 en 8:50
  2. 24 octubre, 2011 en 14:42
  3. 28 octubre, 2011 en 6:35
Los comentarios están cerrados.
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